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          无需RNA纯化,生物样本直接qPCR—新冠病毒检测
           
          2019年,Takara发布了无需RNA提取,可直接使用生物样本进行定量PCR的新产品PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix (or with UNG)(Code No.RR650/651)。该技术不仅引起了分子生物试剂行业的关注,更为大量IVD客户、医药研究人员等带来了简便、快速的体验。尤其在新冠肺炎疫情下,无需RNA提取即可进行新冠病毒核酸检测,可以大大缓解人力、时间等压力。
           
           
          Takara和各国研究人员已经使用PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix对各种样本进行了直接qPCR的实验,成功的检测结果让您可以有充足的信心告别繁琐的RNA提取,进入快速、直接qPCR新时代。
           
          实验例 新冠病毒的直接qPCR检测
          Lübke等科学家在《Journal of Clinical Virology》发表了题为《Extraction-free SARS-CoV-2 detection by rapid RT-qPCR universal for all primary respiratory materials》的文献,文章中作者以PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix(Code No.RR650)为基础,研发了无需RNA提取、直接进行新冠病毒qPCR检测的方法。
           
          下面简要介绍文章中的反应体系和操作流程,实际应用时可能需要用户进行优化。
           
          样本收集
          为了保持反应灵敏度,样品在4℃下冷冻或储存时间不得超过7天。本方案适用于所有主要呼吸样本。
          1. 使用Remel Sputasol (Thermo Fisher Scientific)对粘性样本进行预处理。
          2. 将50 μl样本在99℃下加热灭活5分钟。
          3. 加热的样本4000 rpm离心5分钟。
          4. 向以下反应混合物中添加5 μl上清液。
           
          反应体系
          可以先配制不含样本的反应试剂master mix,分装为20 μl/rxn,冷冻保存,在一周内使用。
          组分 液量(μl)
            PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix (2X) 12.5 μl
            Forward Primer 终浓度400 nM
            Reverse Primer 终浓度400 nM
            qPCR probe 终浓度200 nM
            Viral PBS sample 5 μl
            RNase Free H2O Fill to 25 μl
            Total 25 μl
           
          新冠病毒检测用引物和探针,使用乙型肝炎S抗原基因作为内对照
          Name 目的基因 序列 反应液终浓度
           CoV-E-F  E gene  CTTTTTCTTGCTTTCGTGGTATTCT 400 nM
           CoV-E-R  E gene  TACAAGACTCACGTTAACAATATTGCA 400 nM
           CoV-E-Pr  E gene  FAM-CTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGATTGTG-BHQ 200 nM
           HBV-Taq1  HBV-SynQ*  CAACCTCCAATCACTCACCAAC 200 nM
           HBV-Taq2  HBV-SynQ*  ATATGATAAAACGCGCAGACAC 200 nM
           HBV-IC  HBV-SynQ*  Cy5-CTGCCGAGCTCTGACTA-BHQ 200 nM
          *HBV-SynQ (internal control): 合成的质粒,编码失活的乙型肝炎S抗原。
           
          反应条件
            90℃   30 sec   变性(粗提·核酸纯化)
            60℃   5 min   反转录
            PCR循环圈数: 45
            95℃   5 sec   变性
            60℃   30 sec   退火/延伸
           
          结论
          作者使用上述方法,对于常规方法Ct值<35的样本的直接qPCR检出率为95.8%,对于全部样本(Ct值较高、保存时间较长)的直接qPCR检出率为81.3%。
          该方法具有灵活、快速的特点,可在一个小时内完成对于新冠病毒核酸的qPCR检测。
           
          作者简介
          Dr. Nadine Lübke是医学专家病毒学家,也是德国杜塞尔多夫大学病毒研究所的基因分型和抗性测试负责人。她专注于研究对HIV的抗病毒治疗的抗性,最近获得了德国抗病毒病协会(DVV)和病毒学会(GfV)颁发的2019年临床病毒学科学奖。除了在艾滋病毒抗性测试领域的多年临床和科学工作外,Dr. Nadine Lübke还运用她的专业知识来帮助抗击COVID-19大流行。
           
          您可以点击webinar链接,由Dr. Nadine Lübke为您详细介绍她的团队如何开发出这种简便快速的RT-qPCR检测方法来直接检测SARS-CoV-2,而不需要提取RNA。
           
          杜塞尔多夫医院目前正在使用这种检测方法,在与感染患者接触的医生和工作人员中频繁地筛查COVID-19,这对于防止感染的局部传播至关重要。